New Page 1
 

 

GERİ

Membran Filtrasyon Yöntemi

Membran Filtrasyon Yöntemi

01. Genel Bilgiler

02. Membran Filtrasyon Çalışma Prensibi

03. Membran Filtrasyon ile Mikrobiyolojik Analizin Temel Yaklaşımı

   03.01 Membran Filtrasyon Yönteminin Uygulanması ve Ön Filtrasyon

   03.02 Analiz Edilebilecek Numune ve Özellikleri

   03.03. Besiyeri Seçimi

   03.04. Membran Filtrasyon Yıkama Çözeltisi

   03.05. Sonuçların Verilmesi

04.Laboratuvar Analizlerinde Membran Filtrasyon Yöntemi

05. Katı Gıdalar için Membran Filtrasyon Uygulaması

06. Membran Filtrasyonda Seyreltme (Dilüsyon) Kavramı

07. HGMF Kavramı

 

 

01. Genel Bilgiler

 

Özellikle su analizlerinde mikrobiyolojik yaklaşım ve yasal bir yükümlük olarak membran filtrasyon sistemi kullanılmaktadır.

Membran Filtrasyon Sistemi; paslanmaz çelikten yapılmış vakum filtre tutucusu (tercihe göre tekli, üçlü veya altılı ve yine tercihe göre 100 veya 500 mL huni kapasiteli olmak üzere), vakum pompası, vakum hortumu, hava filtresi, vakum erleni, dozajlama şırıngası, şırınga ucu filtre, paslanmaz çelik pens, besiyeri ve membran filtrelerden oluşmaktadır.

 

Üçlü, 100 mL huni kapasiteli membran filtrasyon sistemi (laboratuvardaki analiz yoğunluğuna bağlı olarak tekli veya altılı membran filtrasyon sistemleri de kullanılmaktadır.)

 

 

 

Vakum Pompası (tekli membran filtrasyon sistemi için 15 litre/dakika, üçlü veya altılı membran filtrasyon sistemi için 26 litre/dakika emiş gücü yeterli olmaktadır.)

 

 

 

Hava Filtresi (vakum sırasında sıvı numunenin pompaya kaçmasını engelleyerek pompanın korunmasını sağlar.)

 

 

 

Cam Vakum Erleni (1-2 litre ve 5 litre musluklu olarak değişik hacimlerde kullanılabilir.)

 

 

 

Paslanmaz Çelik Pens (Yassı uçlu olduğu için, filtrenin rahat taşınabilmesini sağlar.)

 

 

 

Dozajlama Şırıngası (Kurutulmuş hazır besiyerlerinin kullanıma hazır hale gelmesi için sadece 3-3,5 mL steril su ile ıslatmak yeterli olmaktadır. Steril su hazırlama işlemini hızlandırmak ve kolaylaştırmak için dozajlama şırıngası kullanılmaktadır.)

Şırınga Ucu Filtre (Steril su hazırlamak için dozajlama şırıngasına kolayca takılan, tek tek steril ambalajlarda, selüloz asetattan mamul, 0,2 μm gözenek çapına sahip şırınga ucu filtre.)

Steril Huni (Otoklavda sterilizasyona uygundur. Laboratuvar analizlerinde zamandan tasarruf sağlar. 250 mL hacimli olan huniler, membran filtrasyon sistemine, ek bir işlem gerektirmeden kolaylıkla takılabilmektedir. Kullanılmış huniler üst üste koyularak kendi orijinal ambalajında veya otoklav poşetinde, dik olarak otoklava yerleştirilir, 121 ºC’de 15 dakika sterilize edilerek tekrar tekrar kullanılabilirler.)

 

 

02. Membran Filtrasyon Çalışma Prensibi

 

Filtrasyon, sıvı veya gaz içerisindeki istenmeyen partiküllerin bir ayırıcı (seperatör) kullanılarak tutulması işlemidir.

Tamamen fiziksel bir işlem olan filtrasyon ile partikül ve mikroorganizmalar, uygun filtre kullanılarak filtrenin yüzeyinde veya derinliğinde tutulurlar.

Membran Filtrasyonun prensibi kısaca, analizi yapılacak numunenin, içerdiği mikroorganizmanın büyüklüğünden daha küçük gözeneklere sahip membran filtre üzerinden vakum desteği ile süzülmesidir. Böylece numunenin içerdiği bütün mikroorganizmalar membran filtre üzerinde tutulmuş olur. Numune içerisinde bulunan tüm mikroorganizmaları üzerinde tutmuş olan filtre, uygun besiyeri üzerine arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilerek, uygun sıcaklıktaki inkübatöre, filtre kısmı yukarda kalacak şekilde yerleştirilir. Gerekli inkübasyon işleminin sonunda Petri kutusu inkübatörden alınarak oluşan koloniler besiyeri çeşidine bağlı olarak sayılır. Uygulamanın şematik açıklaması için tıklayın.

 

 

03. Membran Filtrasyon ile Mikrobiyolojik Analizin Temel Yaklaşımı

 

Membran Filtrasyon Yöntemi ile yapılan mikrobiyolojik analizlerde, 1,0-2,0 mL temsili numune yerine çok daha büyük miktarlarda numunenin, bazen de ürünün tamamının analizi yapılabilir. Bu özellik, bize ürünün çok az sayıda mikroorganizma içermesi halinde dahi, mikroorganizma yükünü tespit edilebilme imkânı sağlar. Bilindiği gibi, geleneksel yöntemler ile yapılan mikrobiyolojik analizlerde üründen alınan ve tüm ürünü temsil ettiği varsayılan, temsili numune (0,1-1 mL) besiyeri üzerine ekilmektedir.

Analiz sırasında sadece numuneden gelecek mikroorganizmaların değerlendirilmesi için gereken aseptik tekniklere uyulması gerekir (Analiz sırasında ortamdan ve kullanılan diğer apartlardan gelecek mikroorganizmaların, numune değerlendirmesini etkilememesi için Aseptik tekniklere uyulması gerekir.) Bu konuda, gerek bu sitede (Mikrobiyoloji Laboratuvar Kuralları) gerek kolaylıkla erişilebilecek diğer Türkçe kaynaklarda yeterli ayrıntı ile bilgi sağlanabilir.

 

 

03.01 Membran Filtrasyon Yönteminin Uygulanması ve Ön Filtrasyon

 

Membran filtrasyon yönteminde dikkat edilmesi gereken en önemli 2 husus;

-Filtrenin, mikroorganizmaların tutunmuş olduğu yüzeyi üste gelecek şekilde besiyerine yerleştirilmesi,

-Petri kutusunun, filtre yüzeyi yukarı gelecek (kapak yukarıda kalacak) şekilde inkübatöre konulmasıdır.

Ön filtrasyon ataçmanı, asıl filtrenin tıkanmasını önlemek için kullanılan yardımcı ek bir düzenektir. Filtre edilecek numunedeki 8 μm'dan daha büyük partikülleri ön filtre üzerinde tutar.

 

Ön Filtre Ataçmanı ve 8 mikron gözenek çapında, selüloz nitrattan mamul ön filtre, membran filtrasyon tutucusunun üzerine ek bir işlem gerektirmeden kolaylıkla takılabilmektedir.

Uygulamanın şematik açıklaması için burayı tıklayın.

Partikül yükü fazla olmayan su kaynaklarının mikrobiyolojik analizinde ön filtrasyona gerek yoktur. Sadece askıda katı madde miktarı yüksek olan kanalizasyon sularının analizinde gerekebilir ama zaten kanalizasyon suyu gibi yüksek düzeyde mikroorganizma içeren örneklerin mikrobiyolojik analizinde membran filtrasyon öncelikli bir uygulama değildir.

 

 

03.02 Analiz Edilebilecek Numune ve Özellikleri

 

Numune, amaçlanan hacminin filtrasyonu sırasında filtreyi tıkamamalıdır. Partikül yoğunluğu fazla olan numuneler için ön filtre kullanılarak sonuç almak mümkündür.

 

 

03.03. Besiyeri Seçimi

 

Membran filtrasyon uygulamalarında kullanılacak, kullanıma hazır besiyerleri farklı şekillerde elde edilebilir. Aynı isimde ancak farklı markadaki besiyerleri arasında kalite farkı olabileceği kullanıcı tarafından asla göz ardı edilmemelidir.

Membran filtrasyon uygulamasında 2 farklı tip besiyeri kullanılabilir.

-Hazır toz besiyeri ya da formül üzerinden laboratuvarda hazırlanan besiyeri,

-Kullanıma hazır, kurutulmuş (özel bir yöntemle pedlere emdirilerek dehidre edilmiş) besiyeri.

Bunlar membran filtrasyon uygulamalarında yaygın şekilde görülen, kullanıma hazır, kurutulmuş, tek tek Petri kaplarına yerleştirilmiş, steril ve sadece steril damıtık su ilavesi ile kullanıma hazır hale gelen besiyerleridir.

Kurutulmuş besiyerleri yaygın olarak NKS (NPS) adı ile bilinir. Tespit edilecek mikroorganizmaya göre farklı NKS türleri vardır.

 

 

03.04. Membran Filtrasyon Yıkama Çözeltisi

 

Kozmetik sektöründeki yağlı krem veya merhem gibi yağ-su emülsiyonlarında yağ; membran filtrenin gözenekleri üzerinde bir film oluşturarak mikroorganizmanın sağlıklı gelişmesi için gerekli hava alışverişini engeller ve filtrasyon işlemini güçleştirir. Bu gibi örneklerde filtrasyonun kolay yapılabilmesi için öncelikle numuneye yağ su fazını kırıcı steril kimyasal maddeler konulur. Bu kimyasal maddeler Tween 80, Tween 20 veya Tritonx100 olabilir.

Filtrasyon işleminden sonra da numune içerisindeki koruyucu maddeleri membran filtreden uzaklaştırmak için uygun bir yıkama çözeltisi ile membran filtre yıkanır. Burada amaç içinde yüksek miktarda yağ, vazelin, parafin, protein, koruyucu madde olan örneklerde bu maddelerin membran filtre üzerinde kalması engelleyerek mikrobiyel gelişmenin sağlıklı olmasını sağlamaktır. Yıkama çözeltisi olarak; bileşimi  pepton 5,0 g/L, Meat extract 3,0 g/L, Polysorbate (Tween) 80 1,0 g/L olan 80-100 mL kadar çözelti kullanılabilir. Bu formülasyon, ABD farmakopisi (USP) tarafından "Membrane Filter Rinse Fluid" olarak tanımlanmıştır. 

Temiz su kaynaklarının filtrasyonunda bu çözelti ile ilave yıkamaya gerek yoktur.

 

 

03.05. Sonuçların Verilmesi

 

Standart olarak analiz sonuçları, inkübasyon sonrasında (filtre üzerinde elde edilen koloni sayısı/ filtre edilen hacim) olarak verilir. Su analizlerinde çoğunlukla, filtre edilen hacim 100 mL'dir ve analiz edilen mikroorganizmanın 0 olması istenir. Buna göre 0 kob/mL gibi sonuç verilmesi gerekir.

 

 

 

04. Laboratuvar Analizlerinde Membran Filtrasyon Yöntemi

 

Gerek mikrobiyolojik gerekse diğer analizler belirli kurallara göre yapılır. Bu kurallar arasında analiz sonucunun -belirli sapmalar içinde kalmak kaydı ile- doğruluğundan taviz verilmemesi ön plandadır. Sonra, analizin pratik olarak yapılması, maliyet ve süre faktörleri dikkate alınır.

Buna göre 100 mL gibi büyük hacimlerle yapılan analizlerde çok düşük koloni sayısı bulunması hedefleniyorsa ya da doğrudan var/ yok testi yapılıyorsa membran filtrasyon tekniği kullanılması, sağlıklı sonucun elde edilmesi için mutlak bir zorunluluktur.

Örneğin 100 mL su numunesinde koliform bakteri sayısının 0 olması hedefleniyorsa, membran filtrasyon tekniği dışında bilimsel mantık ölçütlerine uyacak başka bir geçerli yöntem yoktur.

Suların (Doğal kaynak Suları, İçme suları vb.) mikrobiyolojik analizinde membran filtrasyon yöntemi yasal bir yükümlülük olarak kullanılmaktadır. (bkz. 17.02.2005 tarihli 25730 sayılı Resmi Gazete)

 

 

05. Katı Gıdalar için Membran Filtrasyon Uygulaması

 

Çok az mikroorganizma içerdiği kabul edilen ya da mikroorganizma içermemesi gereken katı gıdalar da membran filtrasyon sistemi ile mikrobiyolojik olarak analiz edilebilir.

Şeker, tuz gibi suda tam olarak çözünen gıdaların mikrobiyolojik analizi, membran filtrasyon yöntemi ile kolaylıkla yapılabilir. Belirli bir ağırlıkta olmak üzere (1 g, 5 g vb.) numune tartılır, steril Maximum Recovery Diluent gibi uygun bir seyreltme çözeltisinde çözülür ve filtreden geçirilir. Sonuç, tartılmış olan ağırlığa bölünerek 1 gramdaki mikroorganizma sayısı hesaplanır.

Maydanoz gibi yapraklı sebzeler ile meyvelerde mikroorganizmanın sadece yüzeyde olduğu kabul edilir. Buna göre belirli bir ağırlıktaki gıda maddesi tartılır ve yeterli miktarda steril Maximum Recovery Diluent gibi uygun bir seyreltme çözeltisinde çalkalanır. Bu aşamada yüzeydeki mikroorganizmaların seyreltme çözeltisine geçtiği "kabul edilir". Bu çözelti filtreden geçirilir. Sonuç, tartılmış olan ağırlığa bölünerek 1 gramdaki mikroorganizma sayısı hesaplanır.

Peynir, salam gibi gıdalarda mikroorganizma tüm kitleye dağılmış konumdadır. Buna bağlı belirli bir ağırlıktaki gıda maddesi tartılır ve yeterli miktarda steril Maximum Recovery Diluent gibi uygun bir seyreltme çözeltisinde tam olarak homojenize edilir. Homojenizat 5 dakika kadar kendi hâlinde bırakılarak kaba materyalin dibe çökmesi beklenir. Sonra üstte kalan sıvı membran filtreden geçirilir.

 

 

06. Membran Filtrasyonda Seyreltme (Dilüsyon) Kavramı

 

Yukarıda da kısaca bahsedildiği gibi membran filtrasyon sisteminde kullanılacak seyreltme ya da homojenizasyon sıvılarının hacminin hiç önemi yoktur. Örneğin, 5 g tuzun 50 ya da 100 mL Maximum Recovery Diluent içinde çözülmesi sonucu hiç etkilemez çünkü sonuç olarak, 5 g tuz filtreden geçmektedir.

Benzer şekilde 03.04. bölümünde de belirtilen yıkama çözeltisi hacminin de önemi yoktur. Çünkü, steril olduğu için numune içerisindeki mikroorganizma sayısını etkilemeyecektir.

Burada dikkat edilmesi gereken en önemli husus, filtre üzerinde homojen bir dağılım için süzülecek numunenin hacminin en az 5 mL olmasıdır. Buna göre; ister 1 g, ister 5 g ya da 10 g tuz olsun, en az 5 mL Maximum Recovery Diluent içinde çözülmelidir.

Seyreltme ya da homojenizasyonda damıtık su yerine Maximum Recovery Diluent gibi uygun çözücüler kullanılması gereklidir. Aksi halde materyaldeki mikroorganizmalar ozmotik şoka girerek zarar görebilirler. Hatta ozmofil maya analizi yapılacaksa %20 Glikoz çözeltisi kullanılması gerekir. Bu konuda Türkçe olarak erişilebilecek pek çok kaynak vardır.

Bununla beraber, 1 mL dere suyunda mikrobiyolojik analiz yapılacağında bu miktarın filtreden geçirilemeyeceği için 5 mL kadar steril damıtık su ile seyreltilmesi gerektiğine bu sitede değinilmiştir. Dere suyu, içme suyu gibi örneklerde mikroorganizmalar zaten bu ozmotik basınca adapte oldukları için Maximum Recovery Diluent kullanılmasına gerek yoktur. Ancak bu gibi örneklerde seyreltme amacı ile Maximum Recovery Diluent kullanılırsa hiçbir sakıncası olmaz.

 

 

07. HGMF Kavramı

 

Hidrofobik Grid (Izgara) Membran Filtrasyon sistemi, standart filtrasyondan oldukça önemli farklılar içerir. Kullanılan membran filtre üzerinde 20 X 20 olmak üzere 400 kare vardır ve kareler hidrofobik bir ızgara sistemi ile belirlenmiştir. Izgara sistemi hidrofobik (su tutmaz) olduğu için ızgara üzerine gelen mikroorganizma ızgara üzerinde kalmaz, bir şekilde kare olan içine geçer.

İnkübasyon sonunda oluşan koloniler değil, karelerin pozitif ya da negatif olması değerlendirilir. Buna göre bir kare içinde kaç koloni gelişirse gelişsin, sadece pozitif kare olarak değerlendirilir.

Sonuç, EMS = {N X ln [N / (N - A)]} formülü ile elde edilir ve EMS (En Muhtemel Sayı) olarak verilir. Burada N = membran filtre üzerindeki toplam kare sayısı ve A = pozitif olarak sayılan kare sayısıdır. Formüle göre toplam kare sayısının toplam negatif kareye (N-A) bölünmesi ile elde edilen sayının e tabanına göre logaritması (ln) toplam kare sayısı ile çarpılmaktadır.

Bu değerlendirme şekli, membran filtrasyon yöntemine geçmeden önce EMS prensibi ile yapılan değerlendirmelerin membran filtrasyon yöntemine uyarlanması ile ortaya çıkmıştır. Ancak yine de bu sistem ABD dışında uygulanmamaktadır.

 

 





  GERİ

Bu Site Halk Sağlığı Laboratuvar

Bu Site Halk Sağlığı Laboratuvarları için

 Sponsorluğunda hazırlanmış bir sosyal sorumluluk projesidir.

Prof. Dr. Kadir HALKMAN (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü)’ın bilimsel gözetimindedir.
Sayın Hakkı DEMİRTAŞ'a katkılarından ötürü teşekkür ederiz.
© 2008 sumikrobiyolojisi.org Tüm Hakları Saklıdır.